活体成像试剂之腔肠荧光素（Coelenterazine）

背 景：

活体成像技术（optical in vivo imaging）目前主要采用生物发光（bioluminescence）与荧光（fluorescence）两种技术，生物发光法是基于荧光素酶能催化底物（D-Luciferin或Coelenterazine）化学发光的原理，将体外能稳定表达荧光素酶的细胞株植入动物体内，与后期注射入体内的底物发生反应，利用光学系统检测光强度，间接反映出细胞数量的变化或细胞的定位。这项技术已被广泛应用于多个领域，最常用的有肿瘤或疾病动物模型的建立，并可用于病毒学研究、siRNA研究、干细胞研究、蛋白质相互作用研究等。

原 理：

    常见的荧光素酶有两种，分别是萤火虫荧光素酶（firefly luciferase，编码基因是luc）和海肾荧光素酶（Renilla luciferase，编码基因是Rluc），前者的底物是D-Luciferin，后者的底物是Coelenterazine。它们共同的作用原理是在ATP和荧光素酶的催化作用下，底物被氧化发光（不同底物光的颜色和波长不同），当底物过量时，产生的光量子数与荧光素酶的浓度呈正相关性。 

Coelenterazine腔肠荧光素

美国YEASEN提供三种coelenterazine类似物，分别是Coelenterazine，Coelenterazineh，Coelenterazine 400a。虽然三种都可用于相同实验，但是得到的结果有差异。

Coelenterazine：普遍认为是天然的腔肠荧光素，是海肾荧光素酶（Rluc）的作用底物，具有许多用途。可用于检测活细胞中钙离子浓度，基因报告分析，BRET（生物发光共振能量转移）研究，ELISA，HTS，组织或细胞中超氧阴离子和过亚**盐的化学发光检测。

Coelenterazine h:与Renilla荧光素酶或Gaussia荧光素酶使用具有一定的局限性。体外研究中比其他类似物更适合与钙离子激活发光蛋白共用。据报道，Coelenterazine h的发光强度高于天然腔肠荧光素10-20倍，因此是用来检测钙离子浓度微小变化的有力工具。

Coelenterazine 400a: 是BRET研究中Rluc的首选底物，此腔肠素衍生物在390 nm和400nm之间发蓝色光，对GFP acceptor的光发射干扰最小。

（1）Coelenterazine（天然腔肠荧光素）

分子式：C₂₆H₂₁N₃O₃ 分子量: 423.48 g/mol 纯度：95% 保存：-15°C避光，保存在惰性气体下

Protocol：发光检测实验

1）使用管光度计室温下定量检测发光情况，每个样品做三个平行；

2）加入底物10s内立即检测，“integration time”为1 s；

3）对于细菌表达Gluc系统，甲醇溶解底物腔肠素制备10 mM储存液，终浓度为10μmol/L。储存液-20 °C保存，工作液制备过程需避光并置于冰上。 

（2）Coelenterazine 400 a/腔肠素400a

分子式：C₂₆H₂₁N₃O 分子量：: 391.48 g/mol 纯度：95%

储存液制备：

1）开封前将瓶子放到室温温育，以避免产品发生任何的冷凝；

2）用125 μL无水乙醇溶解50 μg Coelenterazine 400 a，最终浓度是0.4μg/μL. ，轻轻混匀；（注：避免用DMSO或其他溶剂来溶解腔肠素400a，因为试剂可能被氧化）

3）分装后避光保存在-20°C，保持干燥； 

（3）Coelenterazine h/ 腔肠素h（from Caliper LifeScience Inc.）

RediJectCoelenterazineh为即用的注射型生物发光底物，特别设计用于体内成像研究。通过最小化产品成分的变化，最小化冻融次数和严格控制不同批次的产品，使用Caliper公司的Coelenterazine h能确保客户得到高重复性的结果。

优 点：

◆预制配方，不同批次间严格控制特别设计用于体内研究；

◆即用型产品通过最小化预成像准备步骤，减少时间和精力；

◆每瓶可用于5只动物的成像研究；（10 瓶/kit）

◆经IVIS成像系统验证，控制体内成像质量；

颜色：黄色溶液（溶于丙二醇/柠檬酸盐）

浓度：150 μg/mL （10瓶无菌溶液，每瓶含1.2 mL浓度为150 μg/mL的Coelenterazine h ）

保存： Store at ≤ -70 °C。

使用及注射剂量：

开始实验前，37 °C水浴锅解冻，避免重复冻融。静脉注射(i.v.)或腹腔注射(i.p.)。

1.        静脉注射：推荐使用剂量15 μg/mouse(100 μL/mouse），用1 ml注射器直接从瓶内吸取溶液，然后用25 gauge或更高的针头注射入小鼠体内。尽快成像检测以获得峰值信号。

2.        腹腔注射：推荐剂量是30 μg/mouse (200 μL/mouse)，方法同上。

应用实例：

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