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提取+建库！FFPE样本文库制备一站式解决方案！

作者：翌圣生物科技（上海）股份有限公司 2021-11-24T08:51 (访问量:6554)

提取+建库！FFPE样本文库制备一站式解决方案！

肿瘤样本是检测基因突变的载体，世界肿瘤发病率居高不下，而医院的低温储存设备捉襟见肘，福尔马林浸泡，石蜡包埋的样本（FFPE）能在常温长时间储存，更受广大临床医生欢迎。据统计，世界各地医院积攒了约4亿FFPE样本，但是福尔马林的固定、石蜡高温浸入、较长保存时间都会导致DNA的交联和不同程度降解，如何从这些海量样本中提取高质量DNA，然后建库测序并分析成为了棘手问题。翌圣生物深耕生命科学领域多年，基于自身深厚的工具酶技术和经验积累，为FFPE DNA的NGS检测提供完整解决方案。


图1.FFPE DNA实验、分析.jpg

图1. FFPE DNA实验、分析

FFPE DNA提取


FFPE DNA提取需经历脱蜡、酶消化、DNA提取共3个步骤。经过潜心优化和精心打磨，翌圣重磅推出FFPE DNA提取试剂盒——MolPure® Magnetic FFPE DNA Kit（鄂汉械备20210919号）。在FFPE脱蜡步骤中，目前市场上常用的脱蜡方式是二甲苯，其强烈刺激性气味，强烈刺激人体食道和胃，并引起呕吐，本试剂盒采用无毒脱蜡液取代二甲苯脱蜡功效，为实验人员健康保驾护航；在酶消化步骤中，翌圣采用精心优化提取体系，确保蛋白酶K能充分消化蛋白和相应核酸酶，保证DNA最大程度释放和不被核酸酶消化，这一点直接体现在最终DNA产量上面。结果显示，翌圣提取总量最高。


图2 各试剂盒提取FFPE DNA结果.jpg

图2. 各试剂盒提取FFPE DNA结果

在DNA提取步骤中，传统的手段有酚氯仿抽提、柱膜法、磁珠法，基于未来大样本量自动化应用场景考量，翌圣采用独家磁珠混合液，操作简便，保证提取DNA纯度，且完美兼容自动化核酸提取仪，大幅提升大样本量FFPE DNA提取效率。

FFPE DNA文库构建



1 酶切法建库

FFPE DNA一般需要打断才能建库，和机械法打断相比，酶切法更温和更高效，对片段损伤更小，且不需要专门打断仪器和耗材，降低了实验成本。针对不同测序平台，翌圣均布局了酶切建库解决方案，助力客户简单高效进行建库实验。针对Illumina平台，翌圣推出Hieff NGS® OnePot Pro DNA Library Prep Kit for Illumina®，采用最新优化的连接酶、最新型高保真酶，改善接头连接时的片段自连并进一步提升扩增的均一性和保真性，持续提升测序结果质量。针对日益普及的MGI平台，翌圣推出Hieff NGS® OnePot II DNA Library Prep Kit for MGI®（酶切法），满足客户对不同测序平台建库需求。

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图3. 文库产出（50ng FFPE DNA）

图4 文库测序下机结果.jpg

图4.文库测序下机结果

2 建库接头

建库完成后的混样测序中，index（或称barcode）是区分各个样本的“身份证”，通常只有几个碱基差异，而实验操作引入的index污染、PCR扩增误差、测序扩增误差均造成标签跳跃 (index hopping)，单端index长接头、双端组合接头CDI(Combinational Dual Index)在区分测序样本来源能力较为薄弱。针对这个测序中频发的难题，在illumina和MGI测序平台，翌圣均布局双端特异性接头UDI（Unique Dual Index）产品，例如，Hieff NGS® Stubby UDI Primer Kit for Illumina®双端特异性接头多达384种，完全满足检测需求。结合文库QC，保证低污染的文库进行混样和测序，将大幅降低index hopping带来的实验困扰，助您实验无忧。

图5. UDI识别index hopping的原理.jpg

图5. UDI识别index hopping的原理

3 DNA磁珠

磁珠纯化是建库关键环节之一，Hieff NGS® DNA Selection Beads基于SPRI (Solid Phase Reverse Immobilization)原理，通过精心优化过的缓冲体系，可用于DNA文库片段分选、纯化，和目前广泛使用的AMPure XP Beads使用方式相同，片段回收效率和文库大小分布均高度吻合，因此可无缝替代AMPure XP Beads，有效降低建库成本。

表1.不同品牌磁珠在不同比例下回收效率比较

磁珠比例

Input DNA (ng)

Yeasen

Be*

Va*

Vd*

Tr*

回收量(ng)

回收率

回收量(ng)

回收率

回收量(ng)

回收率

回收量(ng)

回收率

回收量(ng)

回收率

1.8×

535

534.4

99.89%

524.8

98.09%

518.4

96.90%

566.4

105.87%*

534.4

99.89%

1.2×

518.4

96.90%

537.6

100.49%*

521.6

97.50%

528

98.69%

505.6

94.50%

0.8×

499.2

93.31%

406.4

75.96%

416

77.76%

464

86.73%

425.6

79.55%

0.6×

326.4

61.01%
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