本文来自「CST 博士互助平台」，关注后实时查看更多文章：
——————————————————————————————————————————————————
WB 高背景主要有两种情况：黑乎乎一片或者零星杂点。这种背景与转膜后的各个步骤（如封闭、洗膜、抗体和发光液孵育等）息息相关。以下我将一一揭秘个中缘由，还科研一片绿林。
——作者按
Western blot 系列：1. 背景喧宾夺主，怎么破？
情景一：云里雾里
插图 1，此处假装云雾弥漫的 WB 图
原因：
a. 封闭不彻底
b. 洗膜不彻底
c. 试剂（如抗体等）的品质及使用
d. 膜变干
e. 印记膜被污染
解决方案：
1. 使用 5% 脱脂奶粉*-TBST* 进行封闭，室温缓慢摇晃封闭 1 h。BSA 并非合适的封闭试剂，对于磷酸化靶标，也需使用脱脂奶粉封闭。
* 脱脂奶粉建议使用实验级别奶粉（CST 货号 #9999），不建议使用食品级奶粉。
* 荧光 western，则用 TBS。
2. 洗膜的彻底程度与洗膜液成分及时间有关。
1) 洗膜液成分：盐离子和 Tween®20 的浓度是关键，两者浓度越高，洗涤越彻底。CST 建议使用 137 mM NaCl，20 mM Tris, 0.1% Tween®20 进行洗膜。(使用 CST #9997, 或者自行配置，配方见文末)
2) 洗膜时间：5 min X 3 次。洗膜时，印记膜尽量不要互相重叠，防止洗膜不彻底。
3. 储存已久的缓冲液、配置数天的 5% 脱脂牛奶等，都可能因变质而造成背景升高。此外，实验材料不应重复利用，如滤纸等。
4. 抗体、发光液的品质、使用方法都会造成背景的产生。
1) 一抗：
1-1) CST：根据抗体说明书提示，使用 5% BSA-TBST 或 5% 脱脂奶粉-TBST 稀释；
1-2) 其他：参考供应商抗体说明书；
1-3) 根据说明书，根据合适的推荐倍数稀释。稀释倍数过高或抗体品质原因均可造成高背景。
2) 二抗与 ECL 液：使用 5% 脱脂奶粉-TBST 稀释，稀释倍数参考二抗和 ECL 发光液供应商的说明书，根据 ECL 液灵敏度调整二抗稀释倍数；
拿 CST 的二抗稀释比优化方案举个栗子
5. 孵育抗体、洗膜时，使用的液体需足量，防止干膜。孵育时，注意液体流失或摇床断电等因素。
6. 操作时，需全程戴手套，防止手上的油污对印记膜造成污染。
情景二：星星点点
插图 2，此处又双假装有星星点点的 WB 图
原因：
a. 转膜后，膜上的残留凝胶颗粒造成的非特异性结合；
b. 奶粉未完全溶解；
解决方案：
1. 转膜后，将印记膜在 TBST 中漂洗 5 分钟，去除残留凝胶，再进行封闭。
CST 使用的 NC 膜（#12369），可在转膜后使用 TBST 洗涤。如为荧光 western，则使用 TBS。
其他生产商的印记膜，可参考供应商说明书选择合适的转膜后洗涤液。
2. 延长脱脂奶粉与 TBST* 的混匀时间，使脱脂奶粉彻底混匀。
* 如为荧光 western，则为 TBS。
3. 封闭后可进行洗膜，TBST 5 min X 3 次。
配方赠送
10 X TBS ：24.2 g Tris Base，80 g NaCl 加入 800 mL ddH2O 中，混匀；调整 pH 为 7.6；加 ddH2O 定容至 1L。
1XTBST：100 mL 10XTBS，加 ddH2O 稀释至 1L，加入 1 mL Tween®20，混匀。
点击此处，阅读原文。