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单细胞提取与质谱联用的新型无损提取检测技术

作者：QUANTUM量子科学仪器贸易（北京）有限公司 2019-03-25T14:24 (访问量:5101)

单细胞代谢组学分析能够为对细胞功能分析提供诸多帮助。但是受制于测试条件问题，所得到的结果一直并不理想。随着质谱与单细胞提取手段的发展，目前已经出现了多种不同的提取方法。本文就基于FluidFM提取技术和MALDITOF联用的新型无损提取测试技术进行简述。

众所周知由于细胞异质性的存在，使得每个细胞的实际结构、功能都不完全相同，因此对于单细胞层面的研究变得十分具有意义。当前单细胞测序、转录技术已经发展的较为完备，具有比较成熟的模型。但是单细胞代谢组学的研究却仍处于起步阶段，因为细胞的代谢是十分复杂的。这不仅是细胞内代谢的化学成分种类多，浓度低，并且标记很有可能导致其生物功能被干扰改变。因此使用高灵敏质谱的测量策略有可能解决这一问题。

除了检测仪器，提取手段在检测过程中也起到十分重要的地位。目前的提取主要手段是将细胞消化、悬浮，然后进行裂解得到内容。这种方法需要将细胞悬浮并使用酶进行裂解。这一过程改变了细胞生存的环境，将无法避免的对细胞内部代谢物产生破坏性的影响。此外由于单个细胞的改变也将不可避免的对周边的细胞产生未知的影响。因此能够使用原位提取，在不破坏细胞结构、活力的条件下抽取内容的方法，将极大地帮助研究者得到最为原始的信息。然而直到目前，仍没有理想的方法能够在不破坏细胞情况下进行提取。本文就通过使用FluidFM 技术进行单细胞活体提取并联用质谱进行代谢物的检测进行阐述。

由于先前已经有CELL 报道了使用FluidFM 技术进行活体提取的方法，本文作者通过研究这篇作者的工作，开发了一套适合MALDI-TOF 质谱的分析方法，如图1 所示，并证实这种方法具有很高的灵敏度。

图1，使用FluidFM 和MALDI-TOF 联用的单细胞质谱分析。（A）单细胞提取示意图；（B）将提取物放在MAMS 孔中；（C）喷洒9AA matrix 覆盖表面；（D）MALDI-TOF 质谱分析。

作者通过使用直接购买的400 nm 孔径的FluidFM 探针成功从预先使用GFP-HeLa 细胞中提取出0.8~2.7 pL 的细胞质，一方面确保细胞存活，一方面足够用于检测。随后将细胞提取物放置在质谱专用的95 μm microarrays 上，并立即吹干，以猝灭酶的活性，如图2 所示。

图2，HeLa细胞活体提取过程。（A）提取前；（B）提取中；（C）提取后；（D）细胞质提储存在探针中；（E）移动到MAMS孔上；（F）释放提取液。

随后将9AA 喷涂在microarrays 表面，并放入质谱检测。结果如图3 所示。他们成功通过这种方法检测到了各种酸类和磷酸类化合物，包括核糖核苷酸（cGMP）、UDP、ADP、ATP、活性糖(UDP-GlcNAc、UDP-Glc)、氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)、谷胱甘肽。

图3，直接提取的HeLa 细胞质的代谢产物MS 分析结果。

随后他们使用C¹³标记的葡萄糖对细胞进行培养48h 并对细胞进行提取检测，如图4 所示。

图4，U-C¹³ 标记的葡萄糖培养的HeLa 细胞的代谢产物结果。

一般来说质谱检测一般化合物的同位素峰往往以+1 为主。而U-¹³C 的主体骨架均已使用C¹³标记，因此同位素累积高的物质即为代谢的主要产物。从结果上看同位素累计主要出现在核苷酸和活化糖上面，而谷氨酸和谷胱甘肽并没有出现同位素累积。这说明谷氨酸和谷胱甘肽来源于培养基，而葡萄糖主要通过糖磷酸途径合成活性糖和核酸。如图5 所示。

图5，U-¹³C标记和天然的HeLa代谢产物的分析。箭头表示代谢物的峰。*谷胱甘肽峰。**¹³C UDP GLCNAC的 [M＋13- H]-峰。

总结：
本文通过一种全新的方式，实现了从活细胞中直接提取细胞质研究代谢产物的方法。通过这种方法能够让研究者在不杀死细胞，不改变细胞周边环境的条件下研究细胞最原始的代谢信息，并给持续监测同一个细胞提供了可能。相信在不久的将来使用FluidFM 技术提取技术将会帮助研究者更好的克服单细胞提取障碍，让研究者得到更加可靠、精准的单细胞信息。

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